Spherisorb色譜柱連接到HPLC系統的注意事項
A.色譜柱接頭和系統管路注意事項
所有Spherisorb色譜柱都配備沃特世末端接頭。
Spherisorb分析柱所需的工具：
1/2英寸扳手
9/16英寸扳手
Spherisorb小柱所需的工具：
1/4英寸扳手
小心拿取色譜柱。切勿讓色譜柱掉落或撞擊到堅硬表面，因為這樣會擾亂柱床并且影響色譜柱性能。
1. 正確連接接入和接出色譜柱的1/16英寸外徑不銹鋼管路對于獲得高質量色譜結果至關重要。
2. 使用標準不銹鋼壓力螺母接頭時，確保其正確匹配1/16英寸外徑不銹鋼管路非常重要。擰緊或擰松壓力螺母時，將5/16英寸扳手置于壓力螺母上，并將1/2英寸扳手置于色譜柱末端接頭的六角頭上。
注：在這個過程中，如果任一扳手未正確放在色譜柱管路的搭扳手平面上，都會導致末端接頭松動滲漏。
3. 如果在不銹鋼壓力螺母接頭和色譜柱末端接頭之間出現滲漏，必須組裝新的壓力螺母接頭、管路和錐箍。
4. 色譜柱識別標簽上的箭頭指示了正確的溶劑流向。正確連接接入和接出色譜柱的1/16英寸外徑不銹鋼管路對于獲得高質量色譜結果至關重要。本應成功的分離可能因色譜柱發生額外峰展寬而失敗，認識到這一點非常重要。下文詳細介紹了如何選擇合適的色譜柱接頭和系統管路。由于缺乏行業標準，不同色譜柱制造商使用了不同類型的色譜柱接頭。如果色譜柱末端接頭的類型與現有的管路接頭設置不匹配，可能對色譜分離性能產生負面影響。下文將解釋沃特世和Parker的錐箍及末端接頭之間的差別(圖1)。不同類型的末端接頭要求管路伸出錐箍的長度不盡相同。Spherisorb色譜柱配備的沃特世末端接頭要求管路伸出錐箍0.130英寸。如果您目前使用的是Parker色譜柱，則在安裝Spherisorb色譜柱前必須重置錐箍深度以獲得理想性能。
管路/色譜柱連接正確時(圖2)，管路應接觸到色譜柱末端接頭的底部，二者之間不應有死體積。
流路中存在死體積會影響色譜柱性能。如果將Parker錐箍連接至沃特世末端接頭，就可能出現這種情況(圖3)。
注：如果將裝有Parker錐箍的管路連接到沃特世色譜柱上，會出現死體積。
只有一種方法可以解決這個問題：切斷裝有錐箍的管路末端，在管路上安裝新的錐箍并重新連接。在擰緊螺母前,請確保管路接觸到色譜柱末端接頭的底部。相反，如果是將裝有沃特世錐箍的管路連接到帶Parker末端接頭的色譜柱,則管路末端在錐箍到達合適的密封位置之前就會接觸到底部。這會留下空隙并造成滲漏(圖4)。
注：如果將沃特世錐箍連接到裝有Parker末端接頭的色譜柱上，會導致滲漏。
有兩種方法可以解決這個問題：
1. 進一步擰緊螺母。這樣錐箍會向前移動并到達密封表面。切勿過度擰緊，因為這樣可能會損壞螺母。
2. 切斷管路，更換錐箍并重新連接。
B. 盡可能減小譜帶展寬
圖5顯示了管路內徑對系統譜帶展寬以及峰形的影響。由圖可見，管路內徑較大會引起峰展寬和靈敏度降低。
典型HPLC系統的譜帶展寬體積應為100 μL ± 30 μL(或方差為400 μL2 +/- 36 μL2)。微內徑(內徑2.1 mm)系統的譜帶展寬體積不應超過20~40 μL(或方差不超過16 μL2~64 μL2)。
C. 測量系統體積
系統體積對于放大分離非常重要，因為它會在每次運行開始時產生一段等度保持。在小規模分離中，這段等度保持通常是數倍色譜柱體積，但對于制備型分離，等度保持可能只占制備級色譜柱體積的一部分。設計放大實驗時必須考慮補償該體積，以避免色譜峰畸變(圖7)。
1. 取下色譜柱。
2. 使用乙腈作為流動相A，含0.05 mg/mL尿嘧啶的乙腈作為流動相B(消除無添加劑混合和粘度問題)。
3. 將UV檢測器波長設置為254 nm。
4. 在目標儀器上運行初始方法的流速和預期流速。
5. 采集運行100%流動相A時的基線5 min。
6. 將梯級設置為5 min后變為100%流動相B，然后繼續采集數據5 min。
7. 測量100%流動相A和100%流動相B之間的吸光度差值。
8. 測定該吸光度差值的50%處的時間。
9. 計算梯度起點與50%點之間的時間差值。
10. 將時間差值乘以流速。
